石家莊鑫富達(dá)醫(yī)藥包裝有限公司是專業(yè)生產(chǎn)塑料包裝的知名企業(yè),公司從業(yè)二十余年,以精湛的技術(shù)、完善的管理體系、精益求精的產(chǎn)品服務(wù)于廣大客戶。產(chǎn)品遠(yuǎn)銷到亞洲、歐洲、南北美洲等地區(qū)。是中國獸藥協(xié)會理事單位，受農(nóng)業(yè)部（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部）委托參與制定獸藥包裝團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)。富于厚德，達(dá)于至善。
查看詳情獸藥急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則
一、概述
（一）定義與目的
急性毒性（Acute toxicity）是指藥物在單次或24小時內(nèi)多次給予后一定時間內(nèi)所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)。急性毒性試驗對初步闡明藥物的毒性作用和了解其毒性靶器官具有重要意義。急性毒性試驗所獲得的信息對重復(fù)給藥毒性試驗的劑量設(shè)計和某些藥物臨床試驗起始劑量的選擇具有重要參考價值，并能提供一些與動物藥物過量所致急性中毒相關(guān)的信息。
（二）適用范圍
本指導(dǎo)原則適用于獸用化學(xué)藥物、獸用中藥和獸用天然藥物。消毒劑參考使用。
二、試驗設(shè)計原則
（一）試驗管理
急性毒性試驗須執(zhí)行《獸藥非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》或《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》。
（二）具體問題具體分析
急性毒性試驗的設(shè)計，應(yīng)該在對受試物認(rèn)知的基礎(chǔ)上，遵循“具體問題具體分析”的原則。
對于獸用化學(xué)藥物，應(yīng)根據(jù)受試物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、理化性質(zhì)、同類化合物情況、適應(yīng)癥和用藥動物種群特點(diǎn)、試驗?zāi)康牡冗x擇合適的試驗方法，設(shè)計適宜的試驗方案，并結(jié)合其他藥理毒理研究信息對試驗結(jié)果進(jìn)行全面的評價。
對于獸用中藥和天然藥物，還應(yīng)考慮到其與獸用化學(xué)藥物的不同特點(diǎn)，試驗時應(yīng)根據(jù)各自不同的情況進(jìn)行針對性設(shè)計。
三、基本內(nèi)容
（一）受試物
化學(xué)藥物：受試物應(yīng)采用工藝相對穩(wěn)定、純度和雜質(zhì)含量能反映臨床試驗擬用樣品和/或上市樣品質(zhì)量和安全性的樣品。應(yīng)注明受試物名稱、來源、批號、生產(chǎn)日期、含量（或規(guī)格）、保存條件、有效期及配制方法等，并提供質(zhì)量檢驗報告。試驗中所用溶媒和/或輔料應(yīng)標(biāo)明名稱、標(biāo)準(zhǔn)、批號、有效期、規(guī)格和生產(chǎn)單位等，并符合試驗要求。
中藥、天然藥物：受試物應(yīng)采用能充分代表臨床試驗擬用樣品質(zhì)量和安全性的樣品。應(yīng)采用工藝路線及關(guān)鍵工藝參數(shù)確定后的工藝制備，一般應(yīng)為中試或中試以上規(guī)模的樣品，否則應(yīng)有充分的理由。應(yīng)注明受試物的名稱、來源、批號、、生產(chǎn)日期、含量（或規(guī)格）、保存條件、有效期及配制方法等，并提供質(zhì)量檢驗報告。由于中藥的特殊性，建議現(xiàn)用現(xiàn)配，否則應(yīng)提供數(shù)據(jù)支持配制后受試物的質(zhì)量穩(wěn)定性及均勻性。如果由于給藥容量或給藥方法限制，可采用原料藥進(jìn)行試驗。試驗中所用溶媒和/或輔料應(yīng)標(biāo)明名稱、標(biāo)準(zhǔn)、批號、有效期、規(guī)格及生產(chǎn)單位。
在藥物研發(fā)的過程中，若受試物的工藝發(fā)生變化可能影響其安全性的變化，應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的安全性研究。
化學(xué)藥物試驗過程中應(yīng)進(jìn)行受試物樣品分析，并提供樣品分析報告。成分基本清楚的中藥、天然藥物也應(yīng)進(jìn)行受試物樣品分析。
（二）實驗動物
1. 種屬：不同種屬的動物各有其特點(diǎn)，對同一受試物的反應(yīng)可能會有所不同。從充分暴露受試物毒性的角度考慮，采用不同種屬的動物進(jìn)行試驗可獲得較為充分的安全性信息。因此，對于獸用化學(xué)藥品，急性毒性試驗應(yīng)采用至少兩種哺乳動物進(jìn)行試驗，一般應(yīng)選用一種嚙齒類動物和一種非嚙齒類動物。若未采用非嚙齒類動物進(jìn)行試驗，應(yīng)闡明其合理性。對于獸用中藥、天然藥物，根據(jù)具體情況，可選擇嚙齒類和/或非嚙齒類動物進(jìn)行試驗[參見附錄（二）]。
實驗動物應(yīng)符合國家對相應(yīng)等級動物的質(zhì)量規(guī)定要求，并具有實驗動物質(zhì)量合格證明。
2. 性別：通常采用兩種性別的動物進(jìn)行試驗，雌雄各半。若采用單性別動物進(jìn)行試驗，應(yīng)闡明其合理性。
3. 年齡：通常采用健康成年動物進(jìn)行試驗。如果受試物擬用于或可能用于幼齡動物，必要時應(yīng)采用幼齡動物進(jìn)行試驗。
4. 動物數(shù)：應(yīng)根據(jù)動物種屬和研究目的確定所需的動物數(shù)。動物數(shù)應(yīng)符合試驗方法及結(jié)果分析評價的需要。
5. 體重：試驗中的每批動物初始給藥時的體重差異不宜過大，嚙齒類動物初始給藥時體重不應(yīng)超過或低于平均體重的20%。
（三）給藥途徑
給藥途徑不同，受試物的吸收速度、吸收率和暴露量會有所不同。通常情況下給藥途徑應(yīng)至少包括臨床擬用途徑。如不采用臨床擬用途徑，應(yīng)說明理由。
（四）試驗方法
急性毒性試驗的重點(diǎn)在于觀察動物出現(xiàn)的毒性反應(yīng)。急性毒性急性毒性試驗的試驗方法較多，常用的試驗方法有近似致死量法、最大給藥量法、最大耐受量法、固定劑量法、上下法（序貫法）、累積劑量法（金字塔法）、半數(shù)致死量法等。應(yīng)根據(jù)受試物的特點(diǎn)選擇合適的方法，根據(jù)不同的試驗方法選擇合適的劑量（注釋2）。
（五）給藥劑量
原則上，給藥劑量應(yīng)包括從未見毒性反應(yīng)的劑量到出現(xiàn)嚴(yán)重毒性反應(yīng)的劑量，或達(dá)到最大給藥量。
不同動物和給藥途徑下的最大給藥容量可參考相關(guān)文獻(xiàn)及根據(jù)實際情況來確定。
根據(jù)所選擇的試驗方法，必要時應(yīng)設(shè)置空白和/或溶媒（輔料）對照組。
考慮到胃內(nèi)容物會影響受試物的給藥容量，而嚙齒類動物禁食時間的長短會影響到受試物的腸道內(nèi)吸收和藥物代謝酶活性，從而影響毒性的暴露。因此，動物經(jīng)口給藥前一般應(yīng)進(jìn)行一段時間的禁食，不禁水。
（六）觀察時間
給藥后，一般連續(xù)觀察至少14天，觀察的間隔和頻率應(yīng)適當(dāng)，以便能觀察到毒性反應(yīng)的出現(xiàn)時間及恢復(fù)時間、動物死亡時間等。如果毒性反應(yīng)出現(xiàn)較慢或恢復(fù)較慢，應(yīng)適當(dāng)延長觀察時間。
（七）觀察指標(biāo)
觀察指標(biāo)包括臨床癥狀（如動物外觀、行為、飲食、對刺激的反應(yīng)、分泌物、排泄物等）、死亡情況（死亡時間、瀕死前反應(yīng)等）、體重變化（給藥前、觀察期結(jié)束時各稱重一次，觀察期間可多次稱重，動物死亡或瀕死時應(yīng)稱重）等。記錄所有的死亡情況，出現(xiàn)的癥狀以及癥狀的起始時間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時間、體重變化等。
所有的試驗動物應(yīng)進(jìn)行大體解剖。試驗過程中因瀕死而安樂死的動物、死亡動物應(yīng)及時進(jìn)行大體解剖，其他動物在觀察期結(jié)束后安樂死并進(jìn)行大體解剖。當(dāng)組織器官出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地等改變時，應(yīng)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。
在一些情況下，為獲得更為全面的急性毒性信息，可設(shè)計多個劑量組，觀察更多的指標(biāo)，如血液學(xué)指標(biāo)、血液生化學(xué)指標(biāo)、組織病理學(xué)檢查等，以更好地確定毒性靶器官或劑量反應(yīng)關(guān)系。
四、結(jié)果分析與評價
（一）根據(jù)所觀察到的各種反應(yīng)出現(xiàn)的時間、持續(xù)時間及嚴(yán)重程度等，分析各種反應(yīng)在不同劑量時的發(fā)生率、嚴(yán)重程度。對觀察結(jié)果進(jìn)行歸納分析，判斷每種反應(yīng)的劑量－反應(yīng)及時間－反應(yīng)關(guān)系。
（二）判斷出現(xiàn)的各種反應(yīng)可能涉及的組織、器官或系統(tǒng)等。
（三）根據(jù)大體解剖中肉眼可見的病變，初步判斷可能的毒性靶器官。
（四）說明所使用的計算方法和統(tǒng)計學(xué)方法，必要時提供所選用方法合理性的依據(jù)。
（五）根據(jù)各種反應(yīng)在不同劑量下出現(xiàn)的時間、發(fā)生率、劑量-反應(yīng)關(guān)系、不同種屬動物及實驗室的歷史背景數(shù)據(jù)、病理學(xué)檢查結(jié)果以及同類藥物的特點(diǎn)，判斷所出現(xiàn)的反應(yīng)與藥物的相關(guān)性。判斷受試物引起的毒性反應(yīng)性質(zhì)、嚴(yán)重程度、可恢復(fù)性以及安全范圍；根據(jù)毒性可能涉及的部位，綜合大體解剖和組織病理學(xué)檢查的結(jié)果，初步判斷毒性靶器官。
急性毒性急性毒性試驗的結(jié)果可作為后續(xù)毒理試驗劑量選擇的參考，也可提示一些后續(xù)毒性試驗需要重點(diǎn)觀察的指標(biāo)。
五、試驗報告
按照獸藥GLP要求撰寫試驗報告。
六、術(shù)語
最大給藥量（Maximal feasible dose，MFD）：指動物單次或24小時內(nèi)多次（2~3次）給藥所采用的最大給藥劑量。
最大耐受量（Maximal tolerance dose，MTD）：是指動物能夠耐受的而不引起動物死亡的最高劑量。
半數(shù)致死量（Median lethal dose，LD50）：預(yù)期引起50 %動物死亡的劑量，該值是經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理所推算出的結(jié)果。
七、附錄
（一）一般觀察與指征
以下列出了一些常見的觀察指征及其可能涉及的組織、器官和系統(tǒng)。急性毒性急性毒性試驗中，可能需要對該表格中列出的全部或部分指征進(jìn)行觀察。表1僅作為結(jié)果分析評價的參考，其他科學(xué)、合理的分析均是可以接受的。
表1 一般觀察與指征
觀察 | 指征 | 可能涉及的組織、器官或系統(tǒng) | |
Ⅰ. 鼻孔呼吸阻塞，呼吸頻率和深度改變，體表顏色改變 | A | 呼吸困難：呼吸困難或費(fèi)力，喘息，通常呼吸頻率減慢 | |
1. 腹式呼吸：膈膜呼吸，吸氣時膈膜向腹部偏移 | CNS呼吸中樞，肋間肌麻痹，膽堿能神經(jīng)麻痹 | ||
2.喘息：吸氣很困難，伴隨有喘息聲 | CNS呼吸中樞，肺水腫，呼吸道分泌物蓄積，膽堿能功能增強(qiáng) | ||
B | 呼吸暫停：用力呼吸后出現(xiàn)短暫的呼吸停止 | CNS呼吸中樞，肺心功能不全 | |
C | 紫紺：尾部、口和足墊呈現(xiàn)青紫色 | 肺心功能不全，肺水腫 | |
D | 呼吸急促：呼吸快而淺 | 呼吸中樞刺激，肺心功能不全 | |
E | 鼻分泌物：紅色或無色 | 肺水腫，出血 | |
Ⅱ. 運(yùn)動功能：運(yùn)動頻率和特征的改變 | A | 自發(fā)活動、探究、梳理、運(yùn)動增加或減少 | 軀體運(yùn)動，CNS |
B | 嗜睡：動物嗜睡，但可被針刺喚醒而恢復(fù)正?；顒?/span> | CNS睡眠中樞 | |
C | 正位反射（翻正反射）消失：動物體處于異常體位時所產(chǎn)生的恢復(fù)正常體位的反射消失 | CNS，感覺，神經(jīng)肌肉 | |
D | 麻痹：正位反射和疼痛反應(yīng)消失 | CNS，感覺 | |
E | 僵?。罕３衷藙莶蛔?/span> | CNS，感覺，神經(jīng)肌肉，自主神經(jīng) | |
F | 共濟(jì)失調(diào)：動物行走時無法控制和協(xié)調(diào)運(yùn)動，但無痙攣、局部麻痹、輕癱或僵直 | CNS，感覺，自主神經(jīng) | |
G | 異常運(yùn)動: 痙攣，足尖步態(tài)，踏步，忙碌，低伏 | CNS，感覺，神經(jīng)肌肉 | |
H | 俯臥：不移動，腹部貼地 | CNS，感覺，神經(jīng)肌肉 | |
I | 震顫：包括四肢和全身的顫抖和震顫 | 神經(jīng)肌肉，CNS | |
J | 肌束震顫：包括背部、肩部、后肢和足趾肌肉的運(yùn)動 | 神經(jīng)肌肉，CNS，自主神經(jīng) | |
Ⅲ. 驚厥（癲癇發(fā)作）：隨意肌明顯的不自主收縮或痙攣性收縮 | A | 陣攣性驚厥：肌肉收縮和松弛交替性痙攣 | CNS，呼吸衰竭，神經(jīng)肌肉，自主神經(jīng) |
B | 強(qiáng)直性驚厥：肌肉持續(xù)性收縮，后肢僵硬性伸展 | CNS，呼吸衰竭，神經(jīng)肌肉，自主神經(jīng) | |
C | 強(qiáng)直性-陣攣性驚厥：兩種驚厥類型交替出現(xiàn) | CNS，呼吸衰竭，神經(jīng)肌肉，自主神經(jīng) | |
D | 窒息性驚厥：通常是陣攣性驚厥并伴有喘息和紫紺 | CNS，呼吸衰竭，神經(jīng)肌肉，自主神經(jīng) | |
E | 角弓反張:背部弓起、頭向背部抬起的強(qiáng)直性痙攣 | CNS，呼吸衰竭，神經(jīng)肌肉，自主神經(jīng) | |
Ⅳ. 反射 | A | 角膜性眼瞼閉合反射：接觸角膜導(dǎo)致眼瞼閉合 | 感覺，神經(jīng)肌肉 |
B | 基本條件反射: 輕輕敲擊耳內(nèi)表面，引起外耳抽搐 | 感覺，神經(jīng)肌肉 | |
C | 正位反射：翻正反射的能力 | CNS，感覺，神經(jīng)肌肉 | |
D | 牽張反射：后肢被牽拉至從某一表面邊緣掉下時縮回的能力 | 感覺，神經(jīng)肌肉 | |
E | 對光反射：瞳孔反射；見光瞳孔收縮 | 感覺，神經(jīng)肌肉，自主神經(jīng) | |
F | 驚跳反射：對外部刺激（如觸摸、噪聲）的反應(yīng) | 感覺，神經(jīng)肌肉 | |
Ⅴ. 眼檢指征 | A | 流淚：眼淚過多，淚液清澈或有色 | 自主神經(jīng) |
B | 縮瞳：無論有無光線，瞳孔縮小 | 自主神經(jīng) | |
C | 散瞳：無論有無光線，瞳孔擴(kuò)大 | 自主神經(jīng) | |
D | 眼球突出：眼眶內(nèi)眼球異常突出 | 自主神經(jīng) | |
E | 上瞼下垂：上瞼下垂，針刺后不能恢復(fù)正常 | 自主神經(jīng) | |
F | 血淚癥：眼淚呈紅色 | 自主神經(jīng)，出血，感染 | |
G | 瞬膜松弛 | 自主神經(jīng) | |
H | 角膜渾濁，虹膜炎，結(jié)膜炎 | 眼睛刺激 | |
Ⅵ. 心血管指征 | A | 心動過緩：心率減慢 | 自主神經(jīng)，肺心功能不全 |
B | 心動過速：心率加快 | 自主神經(jīng)，肺心功能不全 | |
C | 血管舒張：皮膚、尾、舌、耳、足墊、結(jié)膜、陰囊發(fā)紅，體熱 | 自主神經(jīng)、CNS、心輸出量增加，環(huán)境溫度高 | |
D | 血管收縮：皮膚蒼白，體涼 | 自主神經(jīng)、CNS、心輸出量降低，環(huán)境溫度低 | |
E | 心律不齊：心律異常 | CNS、自主神經(jīng)、肺心功能不全，心肌梗塞 | |
Ⅶ.流涎 | A | 唾液分泌過多：口周毛發(fā)潮濕 | 自主神經(jīng) |
Ⅷ豎毛 | A | 毛囊豎毛組織收縮導(dǎo)致毛發(fā)蓬亂 | 自主神經(jīng) |
Ⅸ. 痛覺缺失 | A | 對痛覺刺激（如熱板）反應(yīng)性降低 | 感覺，CNS |
Ⅹ. 肌張力 | A | 張力低下：肌張力全身性降低 | 自主神經(jīng) |
B | 張力過高：肌張力全身性增高 | 自主神經(jīng) | |
Ⅺ. 胃腸指征 | |||
排便(糞) | A | 干硬固體，干燥，量少 | 自主神經(jīng)，便秘，胃腸動力 |
B | 體液丟失，水樣便 | 自主神經(jīng)，腹瀉，胃腸動力 | |
嘔吐 | A | 嘔吐或干嘔 | 感覺，CNS, 自主神經(jīng)（大鼠無嘔吐） |
多尿 | A | 紅色尿 | 腎臟損傷 |
B | 尿失禁 | 自主感覺神經(jīng) | |
Ⅻ. 皮膚 | A | 水腫：液體充盈組織所致腫脹 | 刺激性，腎功能衰竭，組織損傷，長時間靜止不動 |
B | 紅斑：皮膚發(fā)紅 | 刺激性，炎癥，過敏 |
（二）急性毒性試驗常用試驗方法
由于受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、活性成分的含量各異，毒性反應(yīng)的強(qiáng)弱也不同，研究者應(yīng)根據(jù)受試物的特點(diǎn)，選擇以下方法或國內(nèi)外公認(rèn)的試驗方法。
本指導(dǎo)原則簡單介紹下列常用的試驗方法，詳細(xì)的實驗技術(shù)細(xì)節(jié)可參考相應(yīng)的文獻(xiàn)。
1. 近似致死劑量法
該方法主要用于非嚙齒類的動物試驗。試驗方法如下：一般采用 6只健康的Beagle犬或猴。犬的年齡一般為6-8月齡，猴的年齡一般為3-5歲，選用其他動物時應(yīng)說明理由。根據(jù)小動物的毒性試驗結(jié)果、受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和其它有關(guān)資料，估計可能引起毒性和死亡的劑量范圍。按50%遞增法，設(shè)計出含數(shù)個劑量的劑量序列表。根據(jù)估計，由劑量序列表中找出可能的致死劑量范圍，在此范圍內(nèi)，每間隔一個劑量給一只動物，測出最低致死劑量和最高非致死劑量，然后用二者之間的劑量給一只動物。如果該劑量下動物未發(fā)生死亡，則該劑量與最低致死劑量之間的范圍為近似致死劑量范圍；如果該劑量下動物死亡，則該劑量與最高非致死劑量間的范圍為近似致死劑量范圍。
2. 最大給藥量法
對于某些低毒的受試物可采用該方法。在合理的最大給藥濃度及給藥容量的前提下，以允許的最大劑量單次給藥或24小時內(nèi)多次給藥(劑量一般不超過5g/kg體重)，觀察動物出現(xiàn)的反應(yīng)。一般使用 10-20只動物，連續(xù)觀察14天。
3. 固定劑量法（Fixed-dose procedure）
該方法最初于1984年由英國毒理學(xué)會提出，不以死亡作為觀察終點(diǎn)，而是以明顯的毒性體征作為終點(diǎn)進(jìn)行評價。
試驗選擇5、50、500和2000 mg/kg四個固定劑量進(jìn)行試驗，特殊情況下可增加5000 mg/kg劑量。實驗動物首選大鼠，給藥前禁食 6-12小時，給受試物后再禁食3-4小時。采用一次給藥的方式進(jìn)行。如無資料證明雄性動物對受藥試物更敏感，首先用雌性動物進(jìn)行預(yù)試。根據(jù)受試物的有關(guān)資料，從上述四個劑量中選擇一個作為初始劑量；若無有關(guān)資料可作參考時，可用500 mg/kg作為初始劑量進(jìn)行預(yù)試，如無毒性反應(yīng)，則用2000 mg/kg進(jìn)行預(yù)試，此劑量如無死亡發(fā)生即可結(jié)束預(yù)試。如初始劑量出現(xiàn)嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，即降低一個檔次的劑量進(jìn)行預(yù)試，如此時動物存活，就在此兩個固定劑量之間選擇一個中間劑量試驗。每個劑量給一只動物，預(yù)試一般不超過5只動物。每個劑量試驗之間至少應(yīng)間隔24小時。給受試物后的觀察期至少7天，如動物的毒性反應(yīng)到第7天仍然存在，尚應(yīng)繼續(xù)觀察7天。在上述預(yù)試的基礎(chǔ)上進(jìn)行正式試驗。每個劑量至少用10只動物，雌雄各半。根據(jù)預(yù)試的結(jié)果，在上述四種劑量中選擇一個可能產(chǎn)生明顯毒性但又不引起死亡的劑量進(jìn)行試驗，如預(yù)試結(jié)果表明，5.0 mg/kg引起死亡，則降低一個劑量檔次進(jìn)行試驗。給受試物后至少應(yīng)觀察2周，根據(jù)毒性反應(yīng)的具體特點(diǎn)可適當(dāng)延長。對每只動物均應(yīng)仔細(xì)觀察并詳細(xì)記錄各種毒性反應(yīng)出現(xiàn)和消失的時間。給受試物當(dāng)天至少應(yīng)觀察記錄兩次，以后可每天一次。觀察記錄的內(nèi)容包括皮膚、粘膜、毛色、眼睛、呼吸、循環(huán)、自主活動及中樞神經(jīng)系統(tǒng)行為表現(xiàn)等。動物死亡時間的記錄要準(zhǔn)確。給予受試物前、后各1周、動物死亡及試驗結(jié)束時應(yīng)稱取動物的體重。所有動物包括死亡或處死的動物均應(yīng)進(jìn)行尸檢，尸檢異常的器官應(yīng)作組織病理學(xué)檢查。固定劑量試驗法所獲得的結(jié)果，參考表2標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價。
表2 固定劑量法試驗結(jié)果的評價
劑 量 (mg/kg) | 試 驗 結(jié) 果 | ||
存活數(shù)<100% | 100%存活毒性表現(xiàn)明顯 | 100%存活無明顯中毒表現(xiàn) | |
5 | 高 毒 (Very toxic) (LD50≤25mg/kg) | 有毒（Toxic） （LD50 25-200 mg/kg） | 用 50 mg/kg 試驗 |
50 | 有毒或高毒，用 5mg/kg 進(jìn)行試驗 | 有害（Harmful） （LD50 200-2000 mg/kg） | 用 500 mg/kg試驗 |
500 | 有毒或有害，用50mg/kg 試驗 | LD50>2000 mg/kg | 用 2000 mg/kg 試驗 |
2000 | 用500 mg/kg 試驗 | 該化合物無嚴(yán)重急性中毒的危險性 | |
4. 上下法（序貫法，Up-and-Down Procedure，UDP）
上下法最大的特點(diǎn)是節(jié)省實驗動物，同時，不但可以進(jìn)行毒性表現(xiàn)的觀察，還可以估算LD50及其可信限，適合于能引起動物快速死亡的藥物。該方法分為限度試驗和主試驗。限度試驗主要用于有資料提示受試物毒性可能較小的情況?？梢詮呐c受試物相關(guān)的化合物或相似的混合物或產(chǎn)品中獲得相關(guān)毒性資料。在相關(guān)毒性資料很少或沒有時，或預(yù)期受試物有毒性時，應(yīng)進(jìn)行主試驗。
限度試驗：是最多用5只動物進(jìn)行的序列試驗。試驗劑量為2000 mg/kg，特殊情況下也可使用 5000 mg/kg。
2000 mg/kg劑量水平的限度試驗: 將受試物給予1只動物。如果該動物死亡，則進(jìn)行主試驗；如果該動物存活，依次將受試物給予另外4只動物，動物總數(shù)為5只。如果1只動物在試驗后期死亡，而其他動物存活，應(yīng)停止對其他動物給藥，對所有動物進(jìn)行觀察，是否在相似的觀察期間也發(fā)生死亡。后期死亡的動物應(yīng)與其他死亡的動物同樣計數(shù)，對結(jié)果進(jìn)行如下評價: 有3只或3只以上動物死亡時，LD50小于2000 mg/kg；有3只或3只以上動物存活時，LD50大于 2000 mg/kg；如果有3只動物死亡，則進(jìn)行主試驗。
5000 mg/kg劑量水平的限度試驗: 特殊情況下，可考慮使用 5000 mg/kg的劑量。將受試物給予1只動物。如果該動物死亡，則進(jìn)行主試驗；如果該動物存活，將受試物給予另外2只動物。如果這2只動物都存活，則LD50大于 5000 mg/kg，停止試驗（即不再對其他動物給藥，觀察14天）。如果這2只動物中有1只死亡或者2只均死亡，將受試物給予另外2只動物，一次1只。如果1只動物在試驗后期死亡，而其他動物存活，應(yīng)停止對其他動物給藥，對所有動物進(jìn)行觀察，是否在相似的觀察期間也發(fā)生死亡。后期死亡的動物應(yīng)與其他死亡的動物同樣計數(shù)，對結(jié)果進(jìn)行如下評價。有3只或3只以上動物死亡時，LD50小于5000 mg/kg；有3只或3只以上動物存活時，LD50大于5000 mg/kg。
主試驗: 由一個設(shè)定的給藥程序組成，在此程序中，每次給藥 1 只動物，間隔至少48小時。給藥間隔取決于毒性出現(xiàn)時間、持續(xù)時間和毒性的嚴(yán)重 程度。在確信前一只動物給藥后能存活之前，應(yīng)推遲按下一劑量給藥。時間間隔可以適當(dāng)調(diào)整，但使用單一時間間隔時，試驗會更簡便。第一只動物的給藥劑量低于LD50的最接近的估計值。如果該動物存活，第二只動物給予高一級劑量；如果第一只動物死亡或出現(xiàn)瀕死狀態(tài)，第二只動物給予低一級劑量。劑量級數(shù)因子應(yīng)選定為 1/（劑量-反應(yīng)曲線斜率估計值）的反對數(shù)（對應(yīng)于斜率2的級數(shù)因子為3.2），并應(yīng)在整個試驗過程中保持不變。當(dāng)沒有受試物的斜率的有關(guān)資料時，使用3.2為劑量級數(shù)因子。使用默認(rèn)級數(shù)因子時，劑量應(yīng)從以下序列中選擇：1.75、5.5、17.5、55、175、550、2000 mg/kg（或有特殊要求時 1.75、5.5、17.5、55、175、550、1750、5000 mg/kg）。如果沒有受試物的致死估計值，應(yīng)該從175 mg/kg開始。如果預(yù)期動物對該受試物的耐受程度變化很大（即，估計斜率小于 2.0），那么開始試驗前應(yīng)考慮增加劑量級數(shù)因子超過按對數(shù)劑量計算的默認(rèn)值 0.5（即，級數(shù)因子為3.2）。同樣，對于已知斜率很陡的受試物，應(yīng)選擇小于默認(rèn)值的級數(shù)因子。在決定是否及如何對下一只動物給藥之前，每只動物都應(yīng)認(rèn)真觀察達(dá)48小時。當(dāng)滿足停止試驗標(biāo)準(zhǔn)之一時，停止給藥，同時根據(jù)終止時所有動物的狀態(tài)計算LD50估計值和可信區(qū)間。用最大可能性法計算LD50值（經(jīng)驗證的計算軟件）。當(dāng)滿足下列停止試驗標(biāo)準(zhǔn)之一時，停止試驗：（a）連續(xù)3只動物存活；（b）任意連續(xù)6只試驗動物中有5只連續(xù)發(fā)生存活/死亡轉(zhuǎn)換；（c）第一只動物發(fā)生轉(zhuǎn)換之后至少有4只動物進(jìn)入試驗，并且其LD50估算值的范圍超出臨界值（2.5 倍）。（首次轉(zhuǎn)換的第4只動物之后，對每次給藥進(jìn)行計算）。
對于LD50和斜率的各種組合，在動物發(fā)生死亡/存活轉(zhuǎn)換之后，用4~6只動物即可滿足停止試驗標(biāo)準(zhǔn)（C）。但在一些情況下，化合物的劑量-反應(yīng)曲線的斜率較小，可能另外還需要增加動物（總共可達(dá) 15 只）。
5. 累積劑量設(shè)計法（金字塔法，Pyramiding dosage design）
在非嚙齒類動物進(jìn)行急性毒性試驗可采用此方法。經(jīng)典的試驗設(shè)計需要8只動物，分對照組和給藥組，每組4只動物，雌雄各2只。 劑量的設(shè)計可以是1、3、10、30、100、300、1000、3000 mg/kg，也可 以采用10、20、40、80、160、320、640、1280 mg/kg，通常隔日給予下一個高劑量，劑量逐漸加大，直到出現(xiàn)動物死亡時或達(dá)到劑量上限時為止。當(dāng)沒有動物死亡時，MLD（最小致死劑量）和LD50大于最高劑量或受限制劑量。當(dāng)在某一劑量所有動物均出現(xiàn)死亡時，MLD和LD50應(yīng)在最后兩個劑量之間。當(dāng)在某一劑量部分動物出現(xiàn)死亡，部分死亡出現(xiàn)在后繼的下一個高劑量，此時，MLD位于首次出現(xiàn)死亡的劑量和前一低劑量之間，LD50則應(yīng)在首次出現(xiàn)動物死亡的劑量和所有動物均死亡的劑量之間。假如沒有動物死亡發(fā)生，常常以最高劑量給予動物5-7天，以確定后續(xù)的重復(fù)給藥試驗中高劑量的選擇。
6. 半數(shù)致死量法
是一種經(jīng)典的急性毒性試驗方法，試驗結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理可獲得受試物的LD50。
八、參考文獻(xiàn)
1.CDE.藥物單次給藥毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則.2014
2.CDE.化學(xué)藥物急性毒性試驗技術(shù)指導(dǎo)原則.2005
3.OECD TG425.Acute Oral Toxicity: Up-and-Down Procedure.2022
4.OECD TG420.Acute Oral Toxicity – Fixed Dose Procedure.2001
來源：獸藥評審中心
原文下載：
獸藥急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則.docx.docx
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